今天给大家分享一个关于引物长度的问题(如何计算引物长度)。以下是这个问题的总结。让我们来看看。
为什么在pcr扩增引物设计中通常要求引物长度大于20nt？
引物浓度:引物浓度尽量遵循酶说明书中给出的浓度，然后给自己定一个范围。也可以根据师兄师姐给的经验浓度自己摸索，因为有时候手册给的参数会有错误！这真的是一个坑。之一次实验，一定要问师兄师姐具体的参数和细节，避免走弯路，浪费试剂。不同酶对的引物浓度也可能略有不同。引物浓度过低或过高，P都出不去。在极少数情况下，引物公司合成的引物F/R可能是错误的。例如，如果R引物少于一半，那么在引物溶解后，根据OD和引物长度对应的摩尔量测量并换算浓度。但是这样的案例很少，我三年才遇到一次，所以公司真的是在骗人！(因为我重复EMSA正好两次，我发现结果和以前不一样。最后发现有一条引物缺了一半。我当时浪费了一整天，真的很辛苦。我能遇到这个奇妙的问题。如果有，和公司反应，重组。还有就是底漆是否降解。
引物设计是否合理:你设计好这个之后，让你的兄弟姐妹帮你检查一下，避免设计好的引物出现问题，导致反复实验，找不到原因。
3)DNA聚合酶:我们实验室用的是KOD FX。这种酶非常好用，扩增能力强，保真度高。酶要在-20保存，使用时放在冰上，加完后尽快放回-20，这样会更好的保护酶，避免一管酶因保存不当，使用后活性下降而无法放大。有时候一种酶无法放大，那就换一种试试。这个实验只能反复尝试。失败多了，就有自己的体会了。使用前请仔细阅读说明书。有时候仔细看说明书就能学到东西。
了解引物如何决定pcr产物的长度。
了解引物如何决定pcr产物的长度。
1.引物长度一般为15-30bp，一般为18-27bp，但不超过38bp；2.引物的GC含量一般为40%-60%，优选45%-55%，上下游引物的GC含量和Tm值应保持接近；3.引物对应的模板序列的Tm值优选为72℃左右，至少在55-80℃之间，Tm值曲线优选为72℃左右。
PCR是一个扩增数。目标基因有700多个，扩增产物长度只有200个。这就是引物选择的问题。引物决定扩增的起始位置。如果你选择的引物刚好在500之后，那么扩增产物的长度只有200。
【科研】PCR引物设计原则
引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素:特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物容易产生错误的扩增产物。扩增效率是指导向子在每个循环中将扩增产物增加一倍达到理论更优值的能力。
遵循以下原则:
1.引物长度:引物的更佳长度约为24或25个碱基。但如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21-28个碱基之间。当扩增长度≥10 kb的片段时，具有25-35个碱基的引物可以提供更好的结果。如果引物太短，产物的特异性会降低，每增加一个核苷酸，引物的特异性可以提高4倍。引物太长，退火过程不完全，与模板结合不充分，导致扩增产物明显减少。
2.引物末端:引物3’末端的最后一个碱基优选为G或C；应该避免在引物的3’末端出现发夹结构。
3.引物G+C:含量引物的GC含量控制在40%-60%之间。
4.Tm值:引物的附加序列，即不与模板配对的序列，不应参与引物Tm值的计算；正向引物和反向引物的Tm值之差更好小于5℃，Tm值更好调整到55℃ -65℃。
5.碱基的分布:引物A、G、C、T的整体分布应尽可能均匀，避开GC或AT含量高的区域；避免四个或四个以上相同碱基的连续出现，或一两个核苷酸的连续重复(如ACCCC或ATATATAT；避免引物中或两个引物之间的互补序列超过5个碱基；两个引物的3’端避免3个碱基以上的互补序列。
6.序列特异性:引物设计后，请使用NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增。注意:PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。
引物的设计原则是什么？
1.引物设计有三个基本原则:
1.引物和模板的序列应该紧密互补。
2.引物之间避免了稳定的二聚体或发夹结构。
3.类似地，引物不能在模板的非靶位点引发DNA聚合(即错配)。
2.2的目的。PCR引物设计就是寻找一对合适的核苷酸片段，能够有效地扩增模板DNA序列。如上所述，引物的质量直接关系到PCR的特异性和成功与否。引物的设计不可能有一个包罗万象的规则来保证PCR的成功，但是遵循一定的原则会有助于引物的设计。
扩展数据:
引物对应的模板序列的Tm值优选为72℃左右，至少在55-80℃之间，Tm值曲线优选为72℃左右。从5’到3’的下降形状也有利于引物和模板的结合。
δg值(自由能)反映了引物和模板之间的结合强度。3’端的δG值相对较低，绝对值不能超过9，否则不利于反应的正确引发。当3’端的δG值为0-2 kcal/mol时，PCR产率几乎为100%，但在-6时仅为40%，在-8时不到20%，接近-10。
百度百科-引物设计
引物长度介绍到此为止。感谢您花时间阅读本网站的内容。别忘了搜索这个网站，获取更多关于如何计算引物长度和引物长度的信息。
